Kryotechnik – Institut für Mehrphasenprozesse – Leibniz Universität Hannover

Die Kryokonservierung ist eine Technologie, welche die Langzeithaltbarmachung von verschiedenen Zelltypen, natürlichen und künstlich hergestellten dreidimensionalen Geweben bei extrem tiefen Temperaturen ermöglicht. Es besteht ein Bedarf an alternativen Kryokonservierungsstrategien, da die weit verbreiteten Kryoprotektiva (CPAs) wie zum Beispiel Dimethylsulfoxid (DMSO) abhängig von Zeit, Temperatur und Konzentration zytotoxisch wirken. Dies führt sowohl zu einer verminderten Vitalität und Funktionalität als auch zur genetischen und epigenetischen Instabilität der Zellen nach dem Auftauen. Ein weiteres Forschungsgebiet der Biokältetechnik ist die Lagerung von künstlich hergestellten dreidimensionalen Geweben. Aktuelle Fortschritte im Tissue Engineering in der Zell- und Organtransplantation und Entwicklung von Schutzmethoden wie das Einbetten oder Einkapseln eröffnen vielversprechende Möglichkeiten zur Lagerung und zum Transport von Stammzellen und therapeutischen Produkten.

Somit sind die Hauptthemen der Arbeitsgruppe Tieftemperaturanwendungen / Kryotechnik (FTAK) die Folgenden:

Geräte und Methoden zum effizienten Einfrieren und Auftauen
Da das Ergebnis der Kryokonservierung zelltypabhängig ist, müssen die Hauptparameter für das Einfrieren und Auftauen für jeden Zelltyp und jedes Gewebe optimiert werden. Zu den verfügbaren Methoden gehören sowohl das direkte Beobachten von Einfrier-/ Auftauvorgängen sowie die Betrachtung der induzierten Eisbildung unter dem Kryomikroskop.
Kryomikroskop mit LINKAM Cryostage
Einfrierapparate mit kontrollierten Kühlraten:
Kommerziell (Asymptote VIA Freeze Research, Planer Kryo 560-16, Askion Workbench C-Line WB230, CM2000)
Entwickelt am Institut (IMP)
Auftauapparate
Kommerzielle Wasserbäder und automatisierte Eigenentwicklungen
Gefriertrocknung
SP Scientific AdVantage Plus 2.0
Martin Christ Epsilon 2-10 D Gefriertrockner
Gerichtete Erstarrung
Power Down
Bridgman
Induzierte Eisbildung
Die Eisbildungstemperatur ist ein Schlüsselparameter, welcher das Ergebnis der Kryokonservierung beeinflusst. Daher arbeiten wir auch an der Entwicklung und Anwendung der folgenden Techniken zur genauen Kontrolle der Eisnukleation:
Verunreinigungsfreie induzierte Eisbildung mittels Laser
Peltier Electrofreezing unter Verwendung eines Einfrierapparats mit genau geregelten Kühlraten
Induzierte Eisbildung mittels Ultraschall
Seeding mittels cold spot ice nucleation (unter dem Kryomikroskop)
Sichere und gering toxische Kryokonservierung
Trotz der Popularität der Kryokonservierung in industriellen, klinischen und akademischen Anwendungsbereichen sind sowohl die Auswirkungen der Kryokonservierung auf subzelluläre Wechselwirkungen als auch auf epigenetische Mechanismen bislang noch nicht eindeutig charakterisiert worden. In früheren Arbeiten am Institut konnte gezeigt werden, dass DMSO das genetische und epigenetische Profil der Zellen beeinflusst. Zudem treten diese Veränderungen nicht zwingend direkt nach dem Auftauen auf, sie könnten auch eine Langzeitwirkung besitzen. Um die ungewünschten Einflüsse der CPA zu reduzieren, haben wir uns diesbezüglich folgende Schwerpunkte gesetzt:
Neue CPAs-Mischungen, um eine Senkung der DMSO-Konzentration zu erzielen
Serumfreie Kryokonservierung
Zellschutz durch Alginat-Kapseln
Physische und biologische Aspekte der Kryokonservierung
Die Effektivität der optimalen Einfrierprotokolle ist von zellspezifischen physischen und biologischen Parametern abhängig. Zu diesen gehören Zellzyklus und -alter, Membranpermeabilität, Interaktion der CPAs mit der Zellmembran und mit Wasser sowie die Osmolalität der kryoprotektiven Lösungen. In diesem Zusammenhang untersuchen wir die folgenden Aspekte:
Wärme- und Massentransport
Zellantwort auf CPAs und niedrige Temperaturen: Analyse der Membranpermeabilität (Kryomikroskop), osmotischer Druck (Osmomat)
Epigenetische und genetische Stabilität
Kryokonservierung von Blut
Außerdem engagieren wir uns in den folgenden Projekten:
Entwicklung und Etablierung einer Methode der Kryokonservierung für tierische Erythrozyten zur Einrichtung von Blutbanken für Nutz- und Kleintiere
Entwicklung eines automatischen Einfrierapparats für menschliche Erythrozyten
Geräte zur Untersuchung der Vitalität und Funktionalität
Microplate Reader Multiscan EX
Cell viability Analyzer Beckman Coulter Vi-Cell XR
Particle counter and cell volume analyser Beckman Coulter Counter Multisizer 3
Confocal Laser Scanning Microscope Zeiss LSM 510 Meta
Fluorescent Microscope Zeiss Axiovert 200M with temperature and humidity controlled incubator